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不同条件对肿瘤球制备单细胞效果的评价

  • 杨璐璐 1 ✉
  • 张永卓 2
  • 龚晓云 2
  • 薛志超 2 ✉
  • 申屠旭萍 1 ✉
1. 中国计量大学 生命科学学院， 浙江 杭州 310018； 2. 中国计量科学研究院，前沿计量科学中心，国家市场监管技术创新中心（质谱）， 北京 100029

中图分类号： TB99

最近更新：2025-02-21

DOI： 10.3969/j.issn.1000-1158.2025.02.19

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EN 引
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摘要

不同的单细胞分离、制备技术会直接影响着细胞状态和生理功能，最终导致相关研究的偏倚。通过培养一致性较强的肿瘤球作为研究模型，采用4种分离方法包括水浴法、金属浴法、机械法、优化水浴法，和3种分解酶包括胶原酶、胰蛋白酶和人肿瘤温和酶解试剂盒来分离多组单细胞样本群并对单细胞数量、活率、代谢产物、药物通路等关键指标进行研究。结果显示，优化水浴法的单细胞活率最高，为（90.27±8.56）%，而在分解酶方面胰蛋白酶表现最佳，单细胞活率为（93.20±3.84）%，获得的细胞数量最多。胶原酶制备的单细胞增殖克隆能力最强，且与肿瘤球相比表达改变的代谢物数量少，接近肿瘤球的真实状态。胰蛋白酶制备的单细胞中参与甲硫代谢的代谢物表达下调，降低癌细胞对药物的敏感度，影响药物效果的评估。

1 引 言

癌症是世界范围内死亡率最高的疾病，是全世界人口主要死亡的原因之一［

1， 2］。深入探究癌症发病机制、优化治疗手段等，是医学科学的前沿，对提高全球人口健康、减轻医疗负担、促进可持续发展至关重要［3］。目前单细胞研究是生命科学探索的重要领域，推动肿瘤研究取得突破性进展。单细胞研究能够揭示生命最基础的单元——细胞之间的异质性［4］。传统生物学研究往往基于细胞群体进行分析，这在一定程度上掩盖了细胞间的个体差异［5， 6］。单细胞分析技术能够深入探究细胞个体层面的分子特征，精确解析每个细胞的基因表达谱、蛋白质组学特征及代谢活动，从而揭示细胞间复杂而微妙的差异。随着单细胞基因组学（single-cell genomics）、转录组学（single-cell transcriptomics）和蛋白质组学（single-cell proteomics）技术的发展，我们得以洞察肿瘤发展过程中细胞间的功能串扰，为理解肿瘤微环境的细胞间相互作用提供了独特的研究机会［7~9］。高效获取单细胞是以上技术的实现关键。

当前研究中，单细胞分离方法多样。CHENG S J等采用gentleMACS处理器酶解加机械破碎分离肿瘤浸润髓系细胞［

10］； AZIZI E等用Liberase TL酶解分离乳腺肿瘤微环境中的单细胞［11］； CHEN Z H等用胰蛋白酶、胶原酶II酶解加不间断摇晃分离膀胱癌相关成纤维细胞［12］； BEJARANO L等用胶原酶、蛋白酶加gentleMACS处理分离脑转移组织中的单细胞［13］；XU J F等用胶原酶I、IV酶解加持续搅拌分离单细胞［14］。这些研究使用的酶及处理方法各异，潜在影响细胞状态和生理活动，导致研究结果偏差。此外，ILAN V等对比了多种酶解离人脑肿瘤及非肿瘤组织的效果，发现溶组织梭菌中性蛋白酶（NP）效果最佳，细胞存活率在胶质瘤、脑转移瘤和非肿瘤性脑组织中分别达93%、85%和89%［15］。 WELCH C E等人则发现I型胶原酶与链霉蛋白酶或透明质酸酶的组合解离能力最强，单细胞活率超90%［16］。然而，研究中评估酶解离效果的角度单一，没有更深一步从细胞内部变化来评估解离出的单细胞与组织的相似程度。

单细胞分析技术的精确性和深度依赖于高效、高质量的单细胞分离过程，这是实现上述技术的基础和前提。高效的单细胞分离技术能够确保从肿瘤组织中获得的单个细胞具有高纯度和活力，这对于后续的基因组、转录组和蛋白质组分析至关重要。高质量的分离意味着与原始肿瘤细胞的差异尽可能小，以保持细胞的原始状态和功能，从而减少分离过程中可能引入的偏差。

此外，分离技术的选择直接影响到后续实验的成功率和数据的可靠性，因此，开发和优化单细胞分离技术是单细胞研究领域的一个重要课题。目前并没有专门的研究深入探讨这一问题。从计量的角度，对肿瘤样本的单细胞提取的不同方法进行全面评估显得尤为迫切。我们以结直肠癌细胞（HCT116细胞）培养的肿瘤球作为研究对象，评估不同分离方法下细胞状态的保真度与原始组织特性的保留程度。统一制备的肿瘤球样本确保了实验起始条件的一致性，有效消除了前处理过程中可能引入的差异性，从而为后续分离单细胞方法的优选提供了坚实的基础。并且，通过对比肿瘤球代谢组数据与分离后细胞代谢组数据，深入剖析不同提取手法对细胞代谢状态的影响；本研究期望能够揭示出最接近体内真实情况的细胞分离策略，为精准医疗、药物筛选及肿瘤生物学研究开辟新的路径。

2 材料与方法

2.1　设备

光学显微镜（OLYMPUS CKX53）；细胞计数仪（Counter Star）；酶联免疫检测仪（Thermo Fisher， Spectrophotometer）；水浴锅（BLEST， BE-4T）；金属浴锅（ThermoM-ixer C）；单细胞悬液制备仪（RWD， DSC-400）；高分辨液相质谱仪（Thermo Scientifi-C Orbitrap Exploris 120）。

2.2　材料

HCT116细胞（BNCC细胞库， 编号287750）；细胞培养96孔板（Nest， 701001）；100 mm细胞培养皿（Nest， 704001）；0.22 μm过滤网（Millex-GP， R1EB95059）；40 μm单细胞过滤网（Biosharp， 710130000）；Atlanti-s HILIC色谱柱（Waters， 186002015）；XBri-dge BEH Amide色谱柱（Waters， 186006724）；Kinetex C18色谱柱（Phen0mene-x， OOF-4462-AN）。

2.3　试剂

RPMI-1640细胞培养基（Gibco， 8123329）；胎牛血清（四季青， 11011-8611）；磷酸盐缓冲液（Gibco， 8123535）；EDTA-胰蛋白酶（Gibco， 25200-056）；胶原酶（Worthington， 43E23627）；CCK8（WJLZ， WJ30025）；结晶紫（Solarbio， C8470）；人肿瘤组织温和酶解试剂盒（RWD， DHTEH-10）。

2.4　实验方法

2.4.1　细胞培养

HCT116细胞（BNCC， #287750）的培养基为添加10% 胎牛血清的90% RPMI-1640，培养于5% CO2，恒温37 ℃ 细胞培养箱中。

2.4.2　肿瘤球培养

在生物实验特别是药物实验中除了2D细胞的使用外，肿瘤球的培养与应用也越来越普遍，常用于3D细胞培养的方案大致可以分为基于支架和非支架的方法［

17， 18］。基于支架的培养方法需要为细胞提供锚定的支架，细胞附着在支架上，就可以增殖并迁移，获得体内肿瘤的典型特征。非支架方法是把细胞培养在特殊器皿或使用某种方法让细胞保持悬浮状态，使细胞聚集，以此得到肿瘤球。如通过旋转和搅拌使细胞保持悬浮状态，得到肿瘤球；悬滴技术是把细胞接种到微型托盘的孔中，再将其倒置，通过表面张力和重力促进肿瘤球的形成。

本研究的肿瘤球培养方法是将细胞接种到低吸附的圆底96孔板，在离心机中300 g离心10 min，使细胞在孔底聚集，形成肿瘤球［

19］，培养周期为7天。

2.4.3　样本的制备

2.4.3.1 4种方法制备单细胞

将肿瘤球从低吸附圆底96孔板转移到15 mL离心管中，使用PBS（磷酸盐缓冲液）清洗2遍，把上清吸取干净，称量肿瘤球的重量。将胶原酶溶于RPMI-1640基础培养基中，配制成2 mg/mL的胶原酶溶液，并按照2.5 mL/mg的比例［

20］，将胶原酶加入含有肿瘤球的15 mL离心管中。按照以下方法进行实验：

1） 机械法

机械法制备单细胞使用单细胞悬液制备仪和仪器专用离心管。把肿瘤球和胶原酶溶液从15 mL离心管中转移到单细胞悬液制备仪专用离心管，然后把专用离心管安装在单细胞悬液制备仪管套中。按下启动键后，离心管管套37 ℃恒温加热，肿瘤球和酶溶液随离心管中的塑料刀片旋转，单细胞制备开始。样本设置3个重复，每0.5 h观察离心管中是否有肉眼可见的肿瘤球，如果有，继续酶解。酶解2 h后，肿瘤球酶解完成。选择40 μm单细胞过滤网过滤酶溶液。使用细胞计数仪（count star）测量酶溶液中的总细胞数量、活细胞数量、细胞结团率，记录并计算细胞活率。

2） 水浴法

将装有肿瘤球和胶原酶溶液的15 mL离心管，放入37 ℃恒温的水浴锅中。样本设置3个重复，每0.5 h观察离心管中是否有肉眼可见的肿瘤球，如果有，继续放入水浴锅中酶解。根据机械法的酶解时间，2 h后，选择40 μm单细胞过滤网过滤酶溶液（溶液还存在少许肿瘤球），使用细胞计数仪测量酶溶液中的总细胞数量、活细胞数量、细胞结团率，记录并计算细胞活率。

3） 优化水浴法

将装有肿瘤球和胶原酶溶液的15 mL离心管，放入37 ℃恒温的水浴锅中。样本设置3个重复，每0.5 h把已经制备的单细胞从胶原酶溶液中分离提出，并重新悬浮在完全培养基中，保持细胞活性。根据机械法的酶解时间，2 h后，收集所有细胞悬液（酶溶液还存在少许肿瘤球），选择40 μm单细胞过滤网过过滤细胞悬液。使用细胞计数仪测量酶溶液中的总细胞数量、活细胞数量、细胞结团率，记录并计算细胞活率。

4） 金属浴法

将装有肿瘤球和胶原酶溶液的15 mL离心管，放入37 ℃恒温的金属浴锅中，并开启震荡模式。样本设置3个重复，每0.5 h观察离心管中是否有肉眼可见的肿瘤球，如果有，继续放入水浴锅中酶解。根据机械法的酶解时间，2 h后，选择40 μm单细胞过滤网过滤酶溶液（溶液还存在少许肿瘤球），使用细胞计数仪测量酶溶液中的总细胞数量、活细胞数量、细胞结团率，记录并计算细胞活率。

2.4.3.2 3种酶制备单细胞

将肿瘤球从低吸附圆底96孔板转移到15 mL离心管中，使用PBS（磷酸盐缓冲液）清洗2遍，把上清吸取干净，测量肿瘤球的体积。使用优化水浴法，按照以下3种酶进行实验：

1） 胰蛋白酶

胰蛋白酶的添加量是肿瘤球50倍［

21］，根据肿瘤球的体积添加1 mL胰蛋白酶。把肿瘤球和胰蛋白酶转移到容量为1.5 mL的EP管，并放入37 ℃恒温水浴锅。样本设置3个重复，按上述优化水浴法的步骤制备单细胞。使用细胞计数仪测量酶溶液中的总细胞数量、活细胞数量、细胞结团率，记录并计算细胞活率。

2） 胶原酶

将胶原酶溶于RPMI-1640基础培养基中，配制成2 mg/mL的胶原酶溶液，并在肿瘤球中添加1 mL。把肿瘤球和胶原酶转移到容量为1.5 mL的EP管，并放入37 ℃恒温水浴锅。样本设置3个重复，按上述优化水浴法的步骤制备单细胞。使用细胞计数仪测量酶溶液中的总细胞数量、活细胞数量、细胞结团率，记录并计算细胞活率。

3）人肿瘤温和酶解试剂盒

按照人肿瘤温和酶解试剂盒说明书中的配比，依次加入3.3 mL RPMI-1640、150 μL酶A、225 μL酶B和18.75 μL酶C，配制成酶溶液，在肿瘤球中添加1 mL。把肿瘤球和酶转移到容量为1.5 mL的EP管，并放入37 ℃恒温水浴锅。样本设置3个重复，按上述优化水浴法的步骤制备单细胞。使用细胞计数仪测量酶溶液中的总细胞数量、活细胞数量、细胞结团率，记录并计算细胞活率。

2.4.3.3 质谱样品制备

将使用3种酶酶解肿瘤球收集到的单细胞和不经过酶处理的肿瘤球用150 mmol甲酸铵清洗2遍，加入80%甲醇，放入-80 ℃冰箱保存，等待质谱分析。

2.4.4 细胞计数仪计数

细胞计数仪检测前需要对死细胞和活细胞进行染色，所用到的AOPI染液是由吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）共同组成，其中吖啶橙（AO）是可以通过完整的细胞膜，与细胞核中的DNA结合发出绿色荧光的染料。碘化丙啶（PI）是只能通过不完整的细胞膜与细胞核中DNA结合发出红色荧光的染料。在激发光的激发下，活细胞发绿色荧光而死细胞发红色荧光。细胞悬液与AOPI染液各取10 μL，把两者按1：1混合均匀，全部转移到计数板上，并选择AOPI计数模式。每个样品3个重复，每个重复随机选择3个视野拍照自动检测计数。

2.4.5 CCK8检测细胞增殖

不同酶制备的细胞按2000个细胞/孔接种于96孔板，在细胞增殖0、2、4、6天后，使用CCK8法和酶联免疫酶标仪测细胞的吸光度OD（optical density）值。CCK8与活细胞结合后，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物，活细胞越多颜色越深。使用移液枪反复吹打96孔板中的肿瘤球使其分散，在光学显微镜下看到96孔板中的肿瘤球被打散，每孔加入20 μL CCK8，37 ℃恒温孵育4 h，使用酶联免疫检测仪检测450 nm处的OD值。

2.4.6 细胞克隆实验

不同酶制备的细胞按1 000个细胞/孔的密度接种于6孔板，每种细胞复孔6个，每3天换一次液，观察14天，结晶紫染色。结晶紫是一种碱性染料，常用于组织或细胞的染色。结晶紫可以使细胞中的DNA、蛋白质和脂肪着色，使细胞核呈蓝色的，细胞质呈粉红色，整个细胞肉眼可见呈深蓝色，死细胞和活细胞均可染色。使用6孔板，用移液枪吸去培养基，2 mL PBS洗涤一次；每孔加2 mL 100%甲醇溶液，放入4 ℃ 冰箱固定10 min；吸去甲醇，每孔加2 mL结晶紫溶液，避光反应30 min；用水冲6孔板至水清澈无颜色［

22］；待6孔板晾干后拍照，使用Image J软件处理照片，对细胞团计数。

2.4.7 质谱方法

非极性分子采用正/负离子模式，正离子模式使用Atlantis HILIC色谱柱（3 μm， 2.1 mm × 150 mm），流动相A为水与10 mmol甲酸铵和0.1%甲酸的混合溶液，流动相B为乙腈和0.1%甲酸的混合溶液。方法程序为15 min，全程保持0.25 mL/min流速，0~1 min流动相B为95%，1~9 min流动相B减少到40%，并保持4 min，接着在2 min上升到95%，程序完成。负离子模式使用的是XBridge BEH Amide色谱柱（2.5 μm， 2.1 mm × 150 mm），流动相A为95%水、5%乙腈、10 mmol氨水和10 mmol乙酸铵的混合溶液，流动相B为5%水、95%乙腈、10 mmol氨水和10 mmol乙酸铵的混合溶液。方法程序保持0.30 mL/min流速，0~1 min流动相B为100%，1~17 min流动相B减少到75%，并保持4 min，接着在1 min上升到100%，保持3 min。非极性分子采用的是正离子模式，使用的是Kinetex C18色谱柱（2.6 μm， 150 mm × 2.1 mm）。方法程序保持0.25 mL/min流速，0~1 min流动相B为0，1~6 min流动相B上升到50%，6~30 min流动相B又上升到100%，保持2 min，接着6 s后流动相B降为0，保持3.9 min。

2.5　实验数据统计与分析

2.5.1 细胞活率计算

使用细胞计数仪测量的数据计算细胞活率，细胞活率计算公式为

细胞活率=活细胞数/总细胞数×100%。

2.5.2 实验数据统计分析

实验数据采用Graphpad Prism 9.0软件进行统计分析，多组间实验数据对比采用Two-Way ANOVA multiple compariso进行统计分析。如图1所示，*代表差异显著性，其中*表示p值<0.05；**表示p值<0.01；***表示p值<0.001；****表示p值<0.0001。代谢物分析采用MetaboAnalyst 6.0和悟空云在线平台。

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图1  不同方法制得的单细胞细胞总数、活细胞数、细胞活率和结团率柱状图

Fig.1  Histograms of the total number of single-cell cells， the number of viable cells， the cell viability and the clumping rate prepared by different methods

3 实验结果与分析

3.1　不同方法分离单细胞效果具有差异性

对用不同方法制备的单细胞使用细胞计数仪计量，并对获取的单细胞细胞总数、活细胞数和结团率统计，并计算细胞活率。图1（a）中，4种方法制备的单细胞总细胞数量由多到少依次为优化水浴法、水浴法、金属浴法和机械法，细胞总数量分别为（8.96 ± 2.83） × 105、（6.33 ± 1.97） × 105、（4.83 ± 1.43 ）× 105、（3.13 ± 1.07） × 105个。优化水浴法制备的单细胞数量最多，与机械法、水浴法、金属浴法制备的单细胞数量相比均具有显著差异。图1（b）中，4种方法制备出的单细胞活细胞数量由多到少依次为优化水浴法、水浴法、金属浴法和机械法，活细胞数量分别为（8.16±2.89）×105、（5.59±1.78）× 105、（3.93±1.37）×105、（2.10±0.82）×105个。优化水浴法制备的活细胞数量最多且与其他3种方法相比均具有显著差异。图1（c）所示，4种方法制备的单细胞活率从高到低依次为优化水浴法、水浴法、金属浴法、机械法，细胞活率依次为（90.27±8.56）%、（88.92±7.40）%、（81.60±15.95）%、（67.73±14.63）%。优化水浴法制备的单细胞细胞活率与机械法相比具有显著差异，与水浴法和金属浴法相比无显著性差异。图1（d）所示，4种方法制备的单细胞结团率从高到低依次为水浴法、优化水浴法、金属浴法、机械法，结团率分别为（35.59 ± 16.01）%、（33.53 ± 10.65）%、（20.64 ± 9.02）%、（17.43 ± 4.77）%。4种方法制备的单细胞结团率之间无显著差异。

以上数据表明，在这4种制备单细胞的方法中，优化水浴法制得的细胞数量最多，活细胞数最多，细胞活率也最高，该方法制备单细胞的效果最好。在酶解肿瘤球制备单细胞的过程中，长时间处在酶溶液中会对已经制备的单细胞造成伤害，因此在肿瘤球酶解过程中定时把单细胞分离提出，可以大大减少酶对细胞的伤害。机械法所用的单细胞悬液制备仪的塑料刀片帮助肿瘤球分散的同时，也会单细胞造成损伤。而优化水浴法避免了这些弊端，表现出最优效果。

采用优化水浴法继续对肿瘤球制备单细胞所用的酶的效果进行比较。如图2所示，分别对胶原酶、胰蛋白酶和人肿瘤温和酶解试剂盒3种酶制备的单细胞的细胞总数量、活细胞数量、细胞活率和结团率进行计量。图2（a）中，3种酶制备的细胞数量从多到少依次为胰蛋白酶、胶原酶、人肿瘤温和酶解试剂盒，细胞数量分别为（9.18 ±2.06） × 105、（8.97 ± 1.40） × 105、（4.67 ± 2.51） × 105个。胰蛋白酶制备的细胞数量与人肿瘤温和酶解试剂盒之间存在显著差异，与胶原酶相比无显著性差异。图2（b）中，3种酶制备的活细胞数量从多到少依次为胰蛋白酶、胶原酶、人肿瘤温和酶解试剂盒，活细胞数量分别为（8.57 ± 2.05） × 105、（7.61 ± 1.51） × 105、（3.21 ± 2.09） × 105个。胰蛋白酶制备的活细胞数量与人肿瘤温和酶解试剂盒之间具有显著差异，与胶原酶之间无显著性差异。图2（c），胰蛋白酶制备的单细胞活率最高，为（93.20 ± 3.84）%，其次是胶原酶，最后是人肿瘤温和酶解试剂盒，细胞活率分别为（84.40 ± 4.81）%、（66.15 ± 9.09）%。胰蛋白酶制备的单细胞活率与胶原酶、人肿瘤温和酶解试剂盒相比相比存在差异。图2（d）中，3种酶制备的单细胞结团率从低到高依次为胰蛋白酶、人肿瘤温和酶解试剂盒、胶原酶，结团率分别为（24.68 ± 7.72）%、（25.45 ± 12.66）%、（35.99 ± 6.89）%。胰蛋白酶与胶原酶相比具有显著差异，与人肿瘤温和酶解试剂盒相比无显著性差异。

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图2  不同酶制得的单细胞的细胞总数、活细胞数、细胞活率和结团率柱状图

Fig.2  Histograms of the total number of cells， the number of viable cells， the cell viability and the clumping rate of a single cell prepared by different enzymes

综上分析，在3种酶中，胰蛋白酶制备的单细胞细胞总数最多，活细胞数量最多，细胞活率最高，胰蛋白酶制备单细胞的效果最好。

3.2　酶影响制备的单细胞的增殖克隆能力

为了更全面地对这3种酶制备单细胞的效果进行评价，进一步比较单细胞的增殖克隆能力。图3（a）为3种酶制备的单细胞增殖不同天数的OD值折线图，在增殖0、2、4、6天时，胶原酶制备的单细胞的OD值最高，胰蛋白酶制备的单细胞的OD值最低。由此可知胶原酶制备的单细胞增殖速度最快，胰蛋白酶制备的单细胞增殖速度最慢。图3（b）中，细胞增殖到第6天时，胶原酶制备的单细胞和人肿瘤温和酶解试剂盒制备的单细胞测得的OD值均显著高于胰蛋白酶制备的单细胞测得的OD值。

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图3  不同酶制备的单细胞增殖结果统计图

Fig.3  Single-cell proliferation results statistical charts prepared by different enzymes

图4（a）~图4（c）中胶原酶制备的单细胞克隆的细胞团最多，其次是胰蛋白酶，最后是人肿瘤温和酶解试剂盒。图4（d）中，对细胞团数进行量化统计，胶原酶、胰蛋白酶和人肿瘤温和酶解试剂盒制备的单细胞克隆细胞团数分别为101.67 ± 14.24、80.20 ± 13.24、68.67 ± 10.98个。

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图4  不同酶制备的单细胞克隆图片及结果统计图

Fig.4  Pictures of single-cell clones prepared by different enzymes and statistical charts of the results

其中胶原酶和人肿瘤温和酶解试剂盒制备的单细胞克隆细胞团数与胰蛋白酶相比具有显著差异。综上分析，胶原酶制备的单细胞增殖克隆能力最强。

3.3　不同酶制备的单细胞与肿瘤球的代谢组之间存在差异

研究比较不同种类的酶对获取的细胞代谢组的影响。对不同酶制备的单细胞和肿瘤球表达的代谢物进行主成分（PCA）和代谢物代谢途径富集分析。PCA图旨在展示不同数据点在有2个主成分构成的低维空间中的分布情况。如图5（a）所示，图中的横坐标和纵坐标分别代表2个不同的主成分，PCA1和PCA2各为44.9%和20.3%。4组样本数据在图中分布在不同区域，反映了使用3种酶制备的单细胞的代谢物与肿瘤球之间代谢物具有差异性。其中胰蛋白酶制备的单细胞与肿瘤球的代谢组之间存在显著。图5（a）同时表明，3种酶制备的单细胞之间代谢物也存在一定差异。

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图5  不同酶制备的单细胞与肿瘤球代谢组主成分图及单细胞增加和减少的代谢物数量统计

Fig.5  Principal component plots of metabolome of single cellsand spheroids prepared by different enzymes， and statistics of the number of metabolites increasing and decreasing in single cells

对3种酶制备的单细胞与肿瘤球相比表达改变的代谢物进行量化统计，如图5（b）所示，胶原酶、人肿瘤温和酶解试剂盒和胰蛋白酶制备的单细胞分别与肿瘤球相比，胰蛋白酶制备的单细胞中表达增加和减少的代谢物数量最多，胶原酶制备的单细胞中表达增加和减少的代谢物数量最少。以上分析表明，在3种酶中，胶原酶制备的单细胞与肿瘤球相比表达改变的代谢物数量少，在代谢组层面差异小，接近肿瘤球的真实状态。

为进一步探究3种酶制备的单细胞中表达改变的代谢物对细胞的影响，对单细胞中表达增加或减少的代谢物进行代谢物功能途径富集分析。图6（a）中，人肿瘤温和酶解试剂盒和胶原酶制备的单细胞表达增加的代谢物都主要参与了类固醇的生成等途径。

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图6  不同酶制备的单细胞相比于肿瘤球表达变化的代谢物功能途径富集

Fig.6  Functional pathway enrichment of metabolites in single cells prepared by different enzymes compared to the expression changes of tumor spheroids

类固醇在体内具有多种作用，在整个生命周期内调节细胞，组织和器官的功能［

23］，在癌症的发展中发挥着积极作用。类固醇中的胆固醇还帮助肿瘤细胞抵抗铁死亡［24］，支持肿瘤存活、生长、迁移［25］，使肿瘤细胞产生耐药性［26］。胰蛋白酶制备的单细胞表达增加的代谢物主要参与缩醛磷脂的合成等。缩醛磷脂是细胞膜中的一种特殊磷脂［27］，与各种疾病有关［28］，在肿瘤细胞选择性逃逸铁死亡的过程中发挥了独特的作用［29］。细胞中缩醛磷脂表达增加，可能影响药物实验结果的准确性。

如图6（b）所示，胶原酶制备的单细胞表达减少的代谢物主要参与供能途径。三羧酸循环为肿瘤细胞生长提供能量［

30］，增强癌细胞生存能力，快速适应转移后的微环境［31］。Warburg效应使肿瘤细胞在有氧环境下削弱有氧呼吸，进行高效糖酵解反应，产生大量能量，制造适合肿瘤环境生存的微环境，为肿瘤细胞制造增殖优势［32］。

人肿瘤温和酶解试剂盒制备的单细胞中表达减少的代谢物主要参与色氨酸代谢等，色氨酸可以增加癌细胞的恶性特性，帮助癌细胞抑制铁死亡促进肿瘤的进展［

33］。胰蛋白酶制备的单细胞表达减少的代谢物主要参与甲硫代谢等，高水平的甲硫代谢增强肿瘤细胞的免疫逃逸，促进肿瘤发展，还会使肿瘤对顺铂等药物产生耐药性［34， 35］。参与这些途径的代谢物表达减少，其发挥的功能减弱，影响癌细胞状态。特别是胰蛋白酶制备的单细胞中参与甲硫代谢的代谢物表达下调，影响癌细胞对药物的敏感度，进而会影响药物效果的评估。

分析中提出了3种酶制备的单细胞中表达改变的代谢物参与的代谢途径，为药物实验中单细胞制备方法的针对性选择提供参考。

3.4　利用3种酶制备的单细胞保留肿瘤组织关键生理特性

恶性肿瘤具有无限繁殖、转移浸染等特性，有的恶性肿瘤还具有耐药性。癌细胞从恶性肿瘤组织中获取，这些癌细胞被培养用于各种细胞实验，如药物实验，研制抗癌药物。从肿瘤组织中获得的单细胞保留肿瘤组织的关键特性，是药物研发成功的基础。

实验对3种酶制备的单细胞与肿瘤球之间表达不变的代谢物进行功能途径富集。如图7所示，3种酶制备的单细胞中表达不变的代谢物参与的生理活动包括溶质载体（SLC）介导的跨膜转运，脂质稳态中的ABC转运蛋白的合成，ABC家族蛋白介导的转运以及血管内皮生长因子（VEGF）信号传导等。

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图7  在不同酶制备的单细胞中表达量不变的代谢物功能富集图

Fig.7  Functional enrichment map of metabolites expressing unchanged in single cells prepared by different enzymes

具体来说，溶质载体超家族（SLC）是一组膜转运蛋白，发挥着重要的作用［

36］。SLC可以对各种底物进行跨膜运输，包括细胞的小分子吸收［37］，细胞生长所需的营养物质以及药物可以通过SLC进行跨膜转运运输到细胞内［38， 39］。ABC转运蛋白家族可以通过结合并水解ATP释放能量实现底物的跨膜运输，参与众多的生理代谢过程［40］。ABC转运蛋白是外排型转运蛋白，癌组织可以通过ABC转运蛋白把抗癌药物排出去［41］，这也是癌症耐药性产生的原因之一。血管内皮生长因子（VEGF）与肿瘤的生长繁殖、侵袭和转移、新生血管生成、凋亡、耐药等特征都密切相关［42］。养分通过肿瘤表面和深处的血管供应到肿瘤细胞深处。这些血管的生长，VEGF在其中起关键作用［43］。

解离后的单细胞需要在最大层度上代表原肿瘤球状态，该研究提供了一组解离后单细胞与原始肿瘤球表达一致的通路，为针对这些通路进行的药物实验，提供数据参考。

4 结 论

本研究探讨了从实体肿瘤组织中提取单细胞的方法及其对肿瘤研究和抗癌药物研发的重要性。通过对不同酶和制备方法的比较，我们发现，优化水浴法和胰蛋白酶在单细胞制备中表现出最佳效果，能够有效提高细胞活率和数量。特别是，胶原酶制备的单细胞在代谢组学分析中与肿瘤球的代谢特征最为接近，适合用于反映肿瘤的真实状态。

此外，研究结果表明，不同的酶制备方法对单细胞的生理特性和代谢活动具有显著影响。胰蛋白酶制备的单细胞与肿瘤球之间存在明显的代谢组差异，这可能会影响药物的作用效果和实验结果的准确性。因此，选择合适的单细胞制备方法对于提高实验的可靠性和有效性至关重要。

在未来的研究中，应进一步优化单细胞提取技术，以确保提取的细胞能够更好地代表原始肿瘤组织的特性。这不仅有助于提高抗癌药物研发的效率，还能为精准医疗提供更为坚实的基础。通过深入理解单细胞的生物学特性，我们期待为肿瘤生物学研究和临床应用开辟新的路径。

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